骨碎补总黄酮对实验性兔膝骨性关节炎软骨及滑膜的影响
发表时间：2010-07-19 浏览次数：589次
作者：戈兵,郭开今,陈宏亮 作者单位：1.泗洪县人民医院骨科,江苏泗洪 2.徐州医学院附属医院骨科,江苏徐州
【摘要】 目的 研究骨碎补总黄酮对兔膝骨性关节炎的治疗效果，探讨其防治骨性关节炎的可行性。方法 32只新西兰大白兔随机分为正常对照组、模型对照组、骨碎补总黄酮组和维固力组。以关节制动法建立兔膝骨性关节炎模型。成模后灌胃给药，8周后镜下观察骨碎补总黄酮对动物模型关节软骨、滑膜组织形态学及基质金属蛋白酶-3表达的影响。结果 骨碎补总黄酮组与模型对照组比较滑膜及软骨组织形态学改变明显较轻(P<0.01)，滑膜、软骨组织中基质金属蛋白酶-3表达减少(P<0.01);骨碎补总黄酮组与维固力组相比，各指标间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 骨碎补总黄酮能够减轻兔膝骨性关节炎的软骨退行性变和滑膜炎症，其作用机制可能与调节基质金属蛋白酶-3表达有关。
【关键词】 骨性关节炎;骨碎补总黄酮;软骨;滑膜;基质金属蛋白酶-3;兔
Effect of osteopractic total flavone on cartilage and synovia
of knees with osteoarthritis in rabbits
GE Bing1, GUO Kaijin2, CHEN Hongliang2
(1. Department of Orthopedics, Sihong People′s Hospital, Sihong County, Jiangsu 223900, China; 2. Department of
Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)
Abstract:Objective To observe the effects of osteopractic total flavone (OTF) on treatment of osteoarthritis in experimental rabbits and to explore the feasibility of using OTF in the prevention and treatment of osteoarthritis.Methods 32 rabbits were randomly divided into normal group, model control group, OTF group and Glucosamine Sulfate Capsules group. The rabbit osteoarthritis model was established by immobilizing the knees of rabbit, followed by gastrogavage. Four weeks later, observe the effects of OTF on the histology of joint cartilage, synovial and the levels of matrix metalloproproteinases (MMP)-3 in cartilage and synovial were observed.Results The histological changes of cartilage and synovia were lower in OTF group than those in model group (P<0.01). The levels of MMP-3 in cartilage and synovia decreased. There were significant differences in OTF group and the model group (P<0.01), while the differences in OTF group and Glucosamine Sulfate Capsules group were insignificant (P>0.05).Conclusion OTF can reduce the degenerative changes of joint cartilage and synovitis in osteoarthritis model, of which the mechanism is related to the adjustment of the levels of MMP-3.
Key words: osteoarthritis; osteopractic total flavone; cartilage; synovia; metalloproteinases-3; rabbit
骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是一种慢性退行性关节疾病，以关节软骨退变及继发性骨质增生和滑膜改变为主要特征。目前，我国已进入老龄化社会，OA的发生也日益增多。骨碎补总黄酮是水龙骨科植物干燥根茎中提取的黄酮类化合物，研究发现骨碎补总黄酮可以抑制巨噬细胞分泌细胞因子[1]。本研究通过观察骨碎补总黄酮对实验性兔膝骨关节炎软骨、滑膜组织形态变化的影响，同时采用免疫组化法对关节软骨及滑膜中金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达进行检测，探讨骨碎补总黄酮治疗骨性关节炎的机制，为今后临床应用骨碎补总黄酮治疗骨性关节炎提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 6月龄新西兰大白兔32只，雌雄不限，平均体重(2.0±0.2) kg，由徐州医学院实验动物中心提供。室温下饲养，自由摄食、饮水。
1.2 主要试剂和设备 骨碎补总黄酮胶囊(北京歧黄制药公司，0.25 g/粒),维固力(爱尔兰罗达药厂，0.25g/粒)，光学显微镜(OLYMPUS)，自动包埋机及石蜡切片机(LEICA)， MMP-3免疫组化检测试剂盒(武汉博士德)。
1.3 动物OA模型制备 采用膝关节伸直位制动法制作兔膝骨关节炎动物模型，将实验动物的左膝用石膏固定于伸直位，6周后去除石膏。建模成功标准：造模侧膝关节间隙较健侧变窄，患膝关节主、被动活动受限;大体解剖可见关节滑膜充血，关节表面失去光泽、粗糙、溃疡形成;镜下滑膜细胞增生、滑膜下层纤维增生。此动物OA模型的病理学变化与人类OA相似。
1.4 动物分组及处理 32只新西兰大白兔随机分为正常对照组、模型对照组、骨碎补总黄酮组和维固力组，每组8只。模型动物去除石膏即日开始灌胃给药，每日1次，共计8周。骨碎补总黄酮与维固力2种药物制成溶液，每日用量根据Meeh-Rubner公式A=K×W2/3×10-4计算，按成人(60 kg)体表面积与家兔体表面积换算。正常对照组每日以生理盐水6 ml·kg-1灌胃;模型对照组每日以生理盐水6ml·kg-1灌胃;骨碎补总黄酮组每日按35 mg·kg-1剂量给予骨碎补总黄酮溶液(6 g·L-1)灌胃，相当于成人剂量0.75 g·d-1;维固力组每日按69 mg·kg-1剂量给予维固力溶液(12 g·L-1)灌胃，相当于成人剂量1.5 g·d-1。
灌胃给药8周后，耳缘静脉栓塞法处死动物。取膝关节股骨髁及部分滑车部位的软骨和滑膜制作光镜标本，常规苏木精-伊红染色，中性树胶封片，镜下组织学检查。MMP-3免疫组化检测试剂盒行MMP-3免疫组化检测。
1.5 评价标准 软骨、滑膜组织形态学评价参照Mankin等[2]的骨性关节炎病理学评分标准评分。MMP-3表达的形态计量研究参考Pelletier等[3]的方法，其表达量用细胞分数即阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示，最大值为100%。
1.6 统计学处理 均数以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
据Mankin′s评分标准，镜下关节软骨及滑膜的退变程度模型对照组评分明显高于正常对照组(P<0.01)，骨碎补总黄酮及维固力组评分均低于模型对照组(P<0.01)，骨碎补总黄酮组与维固力组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。
模型对照组MMP-3水平较正常对照组明显升高(P<0.01)，骨碎补总黄酮组、维固力组MMP-3水平较模型对照组降低(P<0.01)，骨碎补总黄酮组与维固力组的MMP-3水平组间差异无统计学意义。结果见表2。表1 各组关节软骨及滑膜Mankin′s评分结果与正常对照组比较：*P<0.01;与模型对照组比较：#P<0.01表2 各组关节软骨、滑膜中MMP-3的表达 与正常对照组比较：*P<0.01;与模型对照组比较：#P<0.01
3 讨 论
为科学地评价某种干预因素对某种疾病的作用效果，选择并制作正确的动物模型对实验研究非常重要。目前在国外，膝关节制动OA模型已被应用于实验研究之中。该模型最大的优点是无须手术造模，避免了因麻醉或手术给实验带来的各种混杂因素干扰，更接近自然过程，且操作过程大大简化，降低了实验成本。
MMP-3被认为是导致关节软骨组织降解的最重要的蛋白酶[4]。MMP-3作为OA的标志物，其敏感性和特异性分别为84%和90%。定量检测MMP-3能很好地反映软骨退变的病理变化过程。维固力是美国风湿病学院(ACR)推荐的治疗OA的主要药物，现已作为OA治疗的常用药;其有效成分是硫酸氨基葡萄糖，可直接作用于软骨细胞，并能抑制损伤关节软骨酶的释放[5];可以较好地修复软骨，预防OA的进一步发展。
骨碎补总黄酮是自植物根茎中提取的黄酮类化合物，来源广泛，价格低廉，未见明显毒副作用。研究发现骨碎补总黄酮可以抑制巨噬细胞分泌细胞因子，具有良好的抗炎作用。
通过本组兔膝OA模型的实验观察，发现骨碎补总黄酮能够明显改善模型关节软骨及滑膜的组织形态学改变，下调软骨细胞MMP-3的阳性表达，与模型对照组相比差异有统计学意义，说明骨碎补总黄酮有较好的修复和保护OA关节软骨的作用。本实验中骨碎补总黄酮组与维固力在治疗兔OA模型中的作用相似，为下一步开展临床治疗OA提供了实验依据。
【参考文献】
[1] 刘剑刚, 谢雁鸣, 邓文龙. 骨碎补总黄酮抗炎作用的实验研究[J]. 中国天然药物,2004,2(4): 232-234.
[2] Mankin HJ, Johnson ME, Lippiello L. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips [J]. J Bone Joint Surg Am, 1981,63(1):131-139.
[3] Pelletier JP, Lascau-Coman V, Jovanovic D, et al. Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase in experimental osteoarthritis is associated with reduction in tissue levels of catabolic factors[J]. J Rheumatol, 1999,26(9): 2002-2014.
[4] Xie DL, Hui F, Meyers R, et al. Cartilage chondrolysis by fibronectin fragments is associated with release of several proteinases: stromelysin plays a major role in chondrolysis[J]. Arch Biochem Biophys, 1994,311(2): 205-212.
[5] Largo R, Alvarez-Soria MA, Díez-Ortego I, et al. Glu-cosamine inhibits IL-1β-induced NF-kappaB activation in human osteoarthritic chondrocytes[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2003,11(4): 290-298.
