小鼠香烟尼古丁骨髓微核毒性实验的研究
发表时间：2014-01-15 浏览次数：661次
烟草中含有多种毒性物质，尼古丁是其重要成分之一，它约占烟草生物碱总量的95%。尼古丁在常温下为无色或浅黄色油状液体，极易溶于乙醇[1] 。在烟叶中唯有尼古丁会产生耐受、依赖、敏化以及戒断症状[2] 。目前关于香烟成分尼古丁对人体的危害主要从宏观的角度进行阐述，缺乏微观水平的毒性学证据。本实验拟通过香烟尼古丁对小鼠骨髓嗜多染红细胞（Polychromatic erythrocytes，PCE）产生微核的影响进行研究，提供香烟尼古丁对人体危害的细胞谁理学证据。
1 资料与方法
1.1 一般资料：实验动物为健康小白鼠60只，体重25～35 g。由省动物实验中心提供。实验试剂：由市场购得某牌过滤嘴香烟，烤烟型，烟气烟碱量1.12 mg，焦油量17 mg。95%乙醇溶液。顺铂（CDDP）购自伤害恰姆仪器科技有限公司，纯度＞95%，临用前用生理盐水溶解。吉姆萨染色液购自北京索莱宝科技有限公司，临用前调配。
1.2 方法
1.2.1 香烟尼古丁溶液制备：取香烟3支，剥出烟丝并全部投入索氏提取器套筒中[3] 。在75 ml 95%乙醇中连续加热虹吸，虹吸 6次后停止。分别记录第一次及最后一次的虹吸时间。虹吸结束后把装置改为蒸馏装置，记录蒸馏的时间，镏头77℃，蒸出大部分乙醇，再用25%乙醇75 ml溶解残留物。
1.2.2 动物分组及处理：按照成人重度吸烟者吸烟20支/d计算，小鼠每天吸0.01支，再根据染毒所配置的浓度3支/75 ml，0.25 ml稀释液即含0.01支香烟[4] 。将小鼠随机分为6组，10支/组。尼古丁低剂量组：小鼠腹腔注射尼古丁溶液（稀释2倍的原溶液）0.25 ml；尼古丁中剂量组：小鼠腹腔注射尼古丁溶液（稀释1倍的原溶液）0.25 ml；尼古丁高剂量组：小鼠腹腔注射尼古丁溶液（原溶液）0.25 ml；顺铂对照组：小鼠腹腔注射顺铂（0.25 mg/kg）；乙醇对照组：小鼠腹腔注射等量的25%乙醇；生理盐水对照组：小鼠注射等量生理盐水。采用两次染毒法；处死前30 h及处死前6 h 分别染毒1次。最后一次染毒后6 h，将小鼠及颈椎脱臼法处死，取骨髓，制备骨髓切片，常规染色。每只小鼠油镜下观察1 000个嗜多染红细胞（PCE），记录含有微核的PCE细胞数，并计算骨髓嗜多染红细胞细胞微核率（MNPCE），以百分率表示。
1.2.3 观察指标：电子显微镜油镜下观测骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核形成情况。PCE呈灰蓝色、成熟红细胞呈橘黄色。观察嗜色性与核质一致的圆形或椭圆形的微小核，其独立于主核，为主核1/20～1/3大小。
1.3 统计学处理：使用SPSS 13.0对各项资料进行统计、分析，采用χ2 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 小鼠骨髓PCE微核形成：骨髓涂片油镜示：细胞密度适中，可观察到多个嗜多染红细胞细胞（PCE），有一个微核的多见，出现2个及2个以上的微核偶见。骨髓嗜多染红细胞微核形成（油镜：10×100），箭头所指为微核见图1～2。2.2 尼古丁的量效关系：尼古丁低剂量组和乙醇的对照组的微核发生率分别为（5.23±0.77）%和（0.70±0.20）%，两组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。尼古丁在低、高、中不同剂量下，对小鼠骨髓细胞体内染毒后，骨髓嗜多红细胞的微核率（MNPCE）分别为（5.23±0.77）%、（9.87±1.01）%、（12.82±1.81）%，与乙醇对照组（0.70±0.20）% 相比差异有统计学意义（P＜0.05），且存在着明显的剂量关系效应，见图稀释1倍后的浓度，1/25支/ml为原溶液的浓度
3 讨论香烟尼古丁是吸烟成瘾的主要物质，具有兴奋中枢和提神的作用，进入人体后，会产生四肢末梢血管收缩、呼吸心跳加快，血压升高，精神状况改变，同时也是造成高血压、中风等心血管性疾病的主要帮凶[5] 。一旦长期停止吸烟，就会出现烦躁焦虑、注意力分散、情绪低落等戒断症状[6] 。微核实验就是利用细胞生物学方法来检测细胞遗传损伤程度的一种遗传毒物的方法[7] 。微核的形成作用染色体损伤、基因不稳定性甚至患癌风险的一种生物标志物也已被广泛的应用，本研究采用香烟毒性成分尼古丁进行体内骨髓细胞染毒，结果尼古丁低剂量组骨髓细胞微核率与乙醇对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），说明香烟成分尼古丁对微核率有明显影响[8] 。进一步采用尼古丁的不同剂量组染毒小鼠，其MNPCE率分与乙醇对照组相比差异有统计学意义，说明在量效关系上，有诱发小鼠MNPCE率增加的作用（P＜0.05）。除了尼古丁，香烟中包含大约3 500多种化学成分，然而香烟烟雾中包含大约超过4 000种化学物质，其中一些化学物质由于机体的影响作用，甚至有助于尼古丁成瘾，许多研究也都证明了其致人成瘾的作用[9-10] 。本实验通过微核照片以及可供参考的实验数据，提供尼古丁在微观水平的毒理学依据。但是，针对于本实验尼古丁是由香烟溶液提取而来，溶液中其他杂质或香烟烟雾衍生产物中是否具有类似的毒性作用将进一步实验研究证实。本实验的将来研究方向除了为提供香烟尼古丁对小鼠骨髓细胞的损害的数据外，还可从香烟烟雾，香烟其他成分对小鼠骨髓细胞的损伤进行实验研究。
4 参考文献
[1] 丛秀枝.烟草中尼古丁成分研究[D].东华理工大学,2005.
[2] 罗 娟,梁建辉.烟草及尼古丁成瘾的神经递质基础[J].中国药物依赖性杂志,2008,17(2):88.
[3] 林 琏,杜 磊,罗万春.几种常见分离提取设备的分离提取技术 [J].实验科学与技术,2010,8(3):4.
[4] 李延兰,丰慧根,孙 璐,等.高温与香烟联合对小鼠骨髓细胞微核的影响[J].新乡医学院学报,1998,15(2):108. [5] 尼玛曲真.如何认识烟碱及烟碱的直接危害[J].西藏科技,2010,12(1):19.
[6] 廖若敏,周 新.如何认识烟碱及烟碱的直接危害[J].世界临床药物,2009,30(11):695.
[7] 李 宏.微核实验的研究进展[J].安徽农业科学,2009,37(7):2864.
[8] Larmarcovai G,Bonassi S,Botta A,et a1.Genetic polymorphismsand micronucleus formation:a review of the literature[J].Mutat Res,2008,25(3):215.
[9] 顾小红,马宏图,施 强,等.香烟焦油对小鼠急慢性毒性实验研究 [J].吉林医学,2010,31(10):1299.
[10] 施 强,郑勇斌,睢凤英,等.尼古丁对小鼠骨髓细胞微核影响的实验研究[J].实用医学杂志,2011,20(6):118 [收稿日期：2013-05-30 编校：徐强]
