血管瘤细胞培养及其生物学特性分析

作者：孙强　赵静　杜爱英　吴学君　金星　张尚立　苗俊英 　　【关键词】血管瘤?细胞培养?因子Ⅷ?细胞分裂

　　血管瘤（hemangioma）是一种小儿常见肿瘤，对其组织发生、分化及生物学行为的研究甚少。为此我们对血管瘤进行了组织切片观察、瘤体细胞的分离培养，并利用免疫细胞化学法，检测所培养细胞第Ⅷ凝血因子的表达情况，分析其生物学特性和血管瘤细胞的分化基础，初步探索血管瘤体组织的发生机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂第Ⅷ凝血因子相关抗原（Factor Ⅷ related antigen）抗体（兔抗人）和FITC标记的第二抗（山羊抗兔）均购自北京中杉公司。其它试剂均为国产分析纯。

　　1.2 血管瘤细胞的分离培养［1］ 

　　血管瘤切除标本由山东省省立医院血管外科提供。从血管瘤中分离单个瘤体，剥离瘤体包膜，PBS冲洗，剪碎，用0.125%胰酶于37℃孵育30min，然后在室温下用吸管反复吹打，将组织块消化成单个细胞。1000r/min离心10min，弃上清。用2mL含10%小牛血清和70μg/L FGF的M199培养液重悬细胞团，置于35mm的塑料培养皿中，于37℃、含5%CO2的培养箱内培养。每3天换液1次。

　　1.3 细胞生长曲线的绘制

　　每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态并记录细胞数目，取细胞数的对数值绘制生长曲线。

　　1.4 血管瘤细胞第Ⅷ凝因子相关抗原表达检测［2］

　　用间接免疫荧光法检测。弃细胞培养液，用0.01M PBS冲洗一遍，4%多聚甲醛固定，5%正常山羊血清封闭。加入第Ⅷ凝血因子相关抗原的抗体，用A549肺癌上皮细胞作阴性对照，人脐静脉血管内皮细胞做阳性对照。湿盒中4℃过夜。弃第Ⅷ凝血因子相关抗原的抗体，用0.01M PBS冲洗，加入FITC标记的第二抗，37℃反应20min。用0.01M PBS冲洗。用激光扫描共聚焦显微镜观察，分析结果。

　　1.5　组织切片      　　标本经卡诺氏固定液（carnoy）固定，石蜡包埋，7μm连续切片，常规HE染色。

　　1.6  血管瘤组织切片第Ⅷ凝血因子相关抗原免疫组化    

　　将血管瘤组织切片用间接免疫荧光法进行常规免疫组化检测，用激光扫描共聚焦显微镜观察，分析结果。

　　2  结果

　　2.1 血管瘤细胞的形态学        

　　分离的细胞于24h后开始贴壁生长，用相差倒置显微镜观察，发现所分离的细胞呈上皮细胞形态（图1（略））。

　　2.2 细胞生长曲线    　　分离的细胞1周后只有少量细胞贴壁生长，2周后开始生长分裂，3周后细胞开始快速生长，4周后，细胞铺满皿底，细胞总数为2×105/培养皿（图2（略））。

　　2.3  第Ⅷ凝血因子相关抗原表达     

　　第Ⅷ凝血因子相关抗原为哺乳动物血管内皮细胞特异性分子，通过检测该抗原的存在鉴定哺乳动物血管内皮细胞［3］。在激光扫描共聚焦显微镜下，培养细胞及脐静脉内皮细胞（阳性对照）胞浆内呈现绿色荧光，第Ⅷ凝血因子相关抗原表达为阳性；A549上皮细胞（阴性对照）胞浆内无绿色荧光，第Ⅷ凝血因子相关抗原表达为阴性（图3（略））。结果表明所培养的细胞为血管内皮细胞。                                                                            　　2.4 组织学观察    　　对血管瘤组织切片进行常规HE染色，细胞核呈蓝色，胞浆为淡红色，管腔内红细胞呈橘红色。组织局部核密集（图4A右下方），说明细胞以该位置为生发点，不断增生，向内侵袭，形成新的血管腔，小血管明显增生（图4A（略））。

　　2.5  血管瘤组织切片第Ⅷ凝血因子相关抗原免疫组化  

　　血管瘤组织切片第Ⅷ凝血因子相关抗原免疫组化结果显示，血管瘤周围小血管明显增生（图5A（略））。

　　3 讨论

　　血管瘤是一种以血管增生为主要特征的良性肿瘤，起源于中胚层，为毛细血管扩张增生、血管内皮细胞增生及血管畸形所致。由于目前对其组织发生、分化及生物学行为的研究甚少，尚无有效治疗措施。血管和淋巴管内皮细胞过度增殖和异常增殖是肿瘤的主要基础，常有管腔形成并伴随不同程度的纤维细胞和平滑肌细胞增殖，甚至有弹性纤维参与。本实验组织学切片观察可以看到血管内皮细胞增生并侵入腔内，小血管明显增生。

　　从血管瘤组织分离细胞培养血管瘤内皮细胞、生长曲线的停滞期、稳定期长，3周后才达到对数生长期。血管瘤内皮细胞的分离培养将为研究血管瘤的生物学行为提供实验材料，对瘤体的组织学观察和研究为血管瘤的组织发生提供了实验依据，为发现更好的治疗药物提供了实验模型。

　　参考文献

　　［1］Cherchi PL,Campiglio A,Rubattu AEndocavitary betainterferon in neoplastic effusions［J］.Eur J Gynacol Oncol,1990,11(6):477479.

　　［2］寇伯君，李玉林，张丽红.可溶性血管内皮生长因子受体2片段的克隆、表达及其在肿瘤血管形成中的作用［J］.中华肿瘤杂志，2004，26（6）：337341.

　　［3］Jaffe EA，Hoyer LW,Nachman RL.Synthesis of antihemophilic factor antigen by cultrued human endothelial cells［J］.J Clin Invest,1973,52:27572764.