肠内免疫营养对创伤后大鼠肠屏障功能的影响

　　作者：余利坚　徐亮　姚晖　魏仁志　綦晓龙　　作者单位：1泸州市人民医院　肛肠科　(四川　泸州　646000)　　2泸州医学院附属医院　胃肠外科　 (四川　泸州　646000)

　　【摘要】目的研究肠内免疫营养对创伤后大鼠肠道屏障功能的影响。方法: 将30只Wistar大鼠随机分为3组，即对照组、普通肠内营养组、肠内免疫营养组。行胃造瘘术后早期分别给予普通饲料、肠内营养剂、肠内免疫营养剂等，行肠内营养7 d，测量小肠黏膜形态和小肠黏膜IgA+、CD3+、CD4+和CD8+细胞数量。结果：小肠绒毛高度、肠腺隐窝深度、黏膜厚度以及绒毛表面积等相关的形态学参数测量值显示，肠内免疫组均优于对照组(P<0.05)，与普通营养组相比差异无统计学意义 (P>0.05)。对照组和普通肠内营养组大鼠小肠黏膜IgA+、CD3+、CD4+和CD8+细胞数低于肠内免疫营养组 (P<0.05)。结论：肠内免疫营养能较好的改善术后大鼠的小肠机械屏障功能，促进小肠黏膜屏障功能的恢复，增强其肠道免疫功能。

　　【关键词】 肠道营养•肠内免疫营养•大鼠，Wistar

　　Effects of enteral immunonutrition on intestinal mucosal barrieral function of wound rats

　　YU Li-jian1, XU Liang2, YAO Hui2, WEI Ren-zhi2, QI Xiao-long2

　　1Department of General Surgery, Luzhou People’s Hospital (Luzhou 646000 , China)

　　2Department of Gastrointestianal Surgery, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College(Luzhou 646000, China)

　　【ABSTRACT】 Objective: To study effects of enteral immunonutrition on intestinal mucosa barrieral function in wound rats. Methods: 30 Wistar rats were randomly divided into three groups ,with ten rats in each group(ie.control group,enteral nutrition and enteral immunonutrition group). After the germ-free operation of gastrostomy, rats in each group of enteral nutrition were treated with thesocaloric and isonitrogenous nutritional formulas respectively for 7 days.The ileum membrane morphological parameters and the quantity of IgA+,CD3+,CD4+ and CD8+ cell (each HP) in the ileum membrane were detected.Results: The villous height, crypt depth, mucosal thickness and villous surface area of ileum were increased in EN and EIN compared with control group(P<0.05),but it is no significance between them(P>0.05). The quantity of IgA+,CD3+,CD4+ and CD8+ cell is increased in EIN compared with control and EN group. (P<0.05). Conclusion: enteral immunonutrition may improve intestine mechanical barrierl function , promote restoration of the rat small intestine mucous membrane barrier function, and improve intestine immune barrierl function.

　　【KEY WORDS】 Enteral nutrition•Immunounutrition•Rat, Wistar

　　实验表明，当肠道饥饿12～18 h，肠道黏膜结构功能下降，因此手术或创伤后立即给予肠内营养，可以增加肠黏膜的血流量，防止细菌移位[1]。观察重度感染、创伤等严重应激患者的临床情况发现，这类患者机体中存在不同的代谢改变，对营养物质的需求与代谢亦不相同，单纯维持氮平衡和补足热量是不够的。如果肠内给予一些免疫增强物质，以特定方式刺激免疫细胞，不仅能够增强免疫应答功能，维持正常、适度的免疫反应，调整细胞因子的产生与释放，减轻有害或过度炎症反应，还能保护肠屏障功能完整，减少细菌移位。这种方式称免疫增强型肠内营养。研究早期给予肠内免疫营养对手术或创伤后机体的影响，特别是肠道屏障功能的影响，有十分重要的意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物和分组　选用健康清洁级8周龄左右Wistar大鼠30只，体质量190～270 g，雌雄各半，由泸州医学院动物科提供(动物质量合格证号为：川医动字第2401115,质量为一级)。按随机数字表法分为3组：对照组(Control)、普通肠内营养组(EN)和肠内免疫营养组(EIN)，每组各10只。

　　1.2　动物模型制作和处理　大鼠适应性喂养2 d后，经无菌手术构建Wistar大鼠胃造瘘模型，术后置于22℃～26℃、湿度40%～70%的安静、通风良好的环境中单笼饲养。除对照组给予正规大鼠专用饲料外，EN组、EIN组分别给予不同成分的肠内营养剂(等氮等热量)，经胃造瘘管给予肠内营养液。EN组给予瑞素，EIN组给予瑞能。各组能量供应均为1 037 kJ/(kg•d)。于大鼠术后开始喂养，第1天注入全量的1/2,第2天注入全量的2/3,第3天开始注入全量，喂养7 d后处死大鼠，留取末段回肠标本进行检测。

　　1.3　肠内营养液和检测试剂　瑞能(Supportan)和瑞素(Fresubin)均购于Fresenius Kabi-华瑞公司。两种营养剂成分见各自说明书。其中每100mL瑞能添加精氨酸0.625 g，使瑞能每100mL蛋白质由5.85 g增至6.475 g，热量由130 kcal增至132.75 kcal。

　　小鼠抗大鼠CD3+、CD4+和CD8+抗体均购于Serotec公司，山羊抗大鼠IgAα重链特异性抗体购于Rockland公司，SP系列试剂盒和相关的二抗均购于北京中杉生物技术公司。

　　1.4　检测指标和方法

　　1.4.1　肠黏膜形态学观察　留取的末段回肠标本进行HE染色后，每只动物取5张不连续的切片，每张切片顺次取奇数视野观测10个小肠绒毛，并测量绒毛高度、肠腺隐窝深度、黏膜厚度以及绒毛表面积。

　　1.4.2　肠黏膜免疫细胞数量检测　严格按照试剂盒说明对留取标本进行免疫组织化学染色后，每张切片观察不相邻的5个视野,计算每张切片平均每个高倍(×400)视野IgA+、CD3+、CD4+和CD8+的阳性细胞数。

　　1.5　统计学处理　采用SPSS11.0统计软件包进行分析，计量资料以x±s表示，组间均数比较采用方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　30只大鼠中，EN组1只于术后6 h死亡，原因不详。EN组有1只、EIN组有2只大鼠因术后胃造瘘管脱出或堵塞而退出实验，其余26只大鼠完成实验。

　　2.1　小肠黏膜形态学观察　各组大鼠小肠壁层次清楚，黏膜上皮结构完整，无明显充血和炎性细胞浸润(图1)。EN组和EIN组肠黏膜绒毛高而密集，其绒毛高度、腺隐窝深度、黏膜厚度和绒毛表面积均明显高于对照组(P<0.05),EN组和EIN组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　2.2　小肠黏膜免疫细胞数量的比较　IgA+、 CD3+、CD4+、CD8+细胞质呈均匀的棕黄色，细胞核呈深蓝色，绝大部分阳性细胞局限于黏膜层内(图2～5)。EIN组大鼠肠黏膜内免疫细胞数量多于对照组和EN组(P<0.05，表2)，EN组大鼠肠黏膜内免疫细胞数量多于对照组(P<0.05，见表2)。

　　3　讨论

　　胃肠道是人体最重要的免疫器官之一，其完整的屏障功能对于维护健康状态有极其重要的意义。肠道屏障主要包括：黏膜屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障等4部分。任何一部分受损，均可导致肠道屏障功能损害，导致细菌移位，增加相关并发症。

　　肠上皮70%的营养供应来自肠腔内的直接吸收，如果缺乏肠内营养的吸收，肠黏膜将处于病理状态[2]。研究证实，肠道饥饿18～20 h肠上皮就开始萎缩和脱落[3]。术后大鼠机体处于应激状态，小肠黏膜受损，肠道通透性的增加，免疫功能受到抑制，各种炎症因子大量产生。精氨酸、短链脂肪酸等是肠道黏膜能量的重要来源，机体内这类物质需求量远大于产生量，如无外源补充，肠黏膜的结构和功能都将受到损害。普通的大鼠饲料无法提供相应的底物来维持氮平衡和蛋白质合成，导致肠道黏膜更新障碍，屏障作用也有所降低。本研究发现，EN组和EIN组大鼠的小肠绒毛高度、肠腺隐窝深度、黏膜厚度、绒毛表面积均优于对照组(P<0.05),表明肠内营养可以减少应激对大鼠肠道黏膜的损害，促进肠道黏膜更新和修复。而EIN组与EN组之间差异无统计学意义(P>0.05)，表明所有肠内营养均能起到营养肠道上皮的作用。这一现象是否普遍存在，与肠内营养持续时间有无关联，尚不清楚。我们计划针对这些疑问，就肠内免疫营养对肠黏膜形态学的持续影响做进一步研究。

　　淋巴细胞是免疫系统的主要成分，肠道拥有人体最大的黏膜相关淋巴样组织。肠道免疫屏障与肠黏膜中各种淋巴细胞构成的肠相关淋巴样组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)的免疫功能有关。其中T淋巴细胞亚群对于维护肠黏膜的免疫屏障发挥重要的作用[4]。肠道免疫系统中另一个起核心作用的物质是分泌型IgA，其相对分子质量为36 000，是肠道分泌物中含量最丰富的免疫球蛋白。肠黏膜IgA是肠道免疫的第一道防线，在预防细菌黏附和移位上发挥关键作用[5]。本研究发现，通过肠内营养，特别是肠内免疫营养，可以提高大鼠肠道黏膜IgA+、CD3+、CD4+、CD8+细胞的数量，促进应激大鼠肠道黏膜免疫屏障的恢复，提高了大鼠的免疫功能。本研究所用的肠内免疫营养制剂含有多种免疫营养成分，均能发挥提高肠道局部和机体的免疫功能的作用。体外实验证实，培养基中缺乏精氨酸时，细胞生长受抑制，外周血淋巴细胞转化率下降，细胞DNA、RNA和蛋白质合成减少，淋巴因子IL-2、可溶性IL-2受体、γ-IFN产生减少[6]。精氨酸作为多胺和一氧化氮(NO)的前体物质，能够促进细胞的增殖，使真皮细胞的细胞周期进入S期;精氨酸还是羟脯氨酸的前体物质，能够加速胶原合成和创面愈合。精氨酸能够促进自然杀伤细胞活性，激活外周血中的单核细胞，调节T淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子，对机体免疫系统起调控作用。精氨酸的代谢产物精胺、精咪是重要的淋巴细胞增殖的刺激物,能够促进淋巴细胞增殖,增强机体的免疫功能。ω-3多不饱和脂肪酸可以减少炎性介质PGE2的产生，降低IL-1、TNF等细胞因子的产生，调节机体细胞免疫功能、抑制炎症反应。RNA是细胞分裂增殖的重要底物，可能参与调节细胞免疫应答反应。核苷酸能诱导IL-1β、TNF-α、INF-γ的释放，增强循环T淋巴细胞的数目和功能，提高巨噬细胞活性，刺激NK细胞的细胞毒作用[7]。

　　对创伤后大鼠的应用肠内免疫营养，能够保护肠道黏膜，改善肠道黏膜屏障功能;特定的免疫增强物质能够保护和改善肠道免疫屏障功能，最终提高免疫能力和手术耐受能力，促进肠道正常结构和功能的恢复。

　　【参考文献】

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　　[3] Kantsos H, Papadopoulos S, Perrea D,et al. Effects of nimodipine administration on small bowel mucosa under conditions of laparotomy and consequent 48-hour starvation in a rat model[J]. Ann Ital Chir, 2008,79(2):143-149.

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　　[6] Popovic PJ, Zeh HJ 3rd, Ochoa JB. Arginine and immunity[J].J Nutr,2007,137(6Suppl 2):1681S.

　　[7] 徐亮，姚晖，庞明辉，等.胃肠道恶性肿瘤围手术期肠内免疫营养的临床研究[J].中华现代外科学杂志， 2005,2(15)：1355-1357.