核转录因子κB圈套策略对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

　　作者：曾少波,江斌,菅志远　　作者单位：郧阳医学院附属太和医院肝胆外科，湖北 十堰

　　【摘要】 目的:观察NFκB圈套寡核苷酸(Decoy ODNs)对NFκB活性的影响，进一步探讨其对人肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制。方法:设计NFκB圈套寡核苷酸，将FITC标记的NFκB Decoy ODNs转染HepG2，共聚焦显微镜观察其核内定位，描记生长曲线;凝胶阻滞法(EMSA)检测转染前后NFκB活性;再分别用流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡情况。Western blot检测HepG2细胞中Bcl2和Fas的含量。结果:NFκB Decoy ODNs转染HepG2细胞后定位于胞核，NFκB活性明显下降，其显著抑制细胞生长，促进HepG2细胞凋亡;低活性NFκB 可以下调Bcl2、增加Fas的表达水平。结论:NFκB圈套寡核苷酸促进肝癌细胞HepG2凋亡的机制可能与其下调NFκB的活性，使促凋亡蛋白Fas表达增加和降低抑凋蛋白Bcl2表达有关。

　　【关键词】 NFκB;寡核苷酸;HepG2细胞;凋亡

　　Effects of Nuclear Factorkappa B Decoy Oligonucleotide on the Apoptosis of HepG2 Cells ZENG Shaobo,JIANG Bin,JIAN Zhiyuan,ZHANG Min,LIU Jiong (Department of Hepatobiliary Surgery,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract： Objective To investigate the effect of NFκB decoy oligodeoxynucleotides(ODNs) on the activity of NFκB and its mechanism in apoptosis of liver cancer cells HepG2.Methods The NFκB decoy ODNs was designed,FITClabelled NFκB decoy ODNs was transfected into HepG2,the nuclear localization was observed with confocal microscope,the growth curve was established;the activity change of NFκB was detected with electrophoretic mobility shift assays(EMSA) pre and post transfection;the effect of low activity NFκB on the cell proliferation was evaluated with flow cytometry and TUNEL,the expression change of Bcl2 and Fas induced with low activity NFκB were measured with Western blot.Results The decoy ODNs was located in the nuclei of HepG2 cells,the activity of NFκB was significantly decreased,the growth of HepG2 was significantly inhibited,the apoptosis of liver cancer cells HepG2 was enhanced;the low activity of NFκB upregulated the expression of Fas and downregulated the expression of Bcl2.Conclusion The NFκB decoy ODNs could increase the apoptosis of liver cancer cells HepG2 and its mechanism may be related to the downregulation of NFκB activity,upregulation of Fas expression and downregulation of Bcl2 expression.

　　Key words： NFκB;Oligonucleotide;HepG2 cell;Apoptosis

　　核转录因子κB(Nuclear factorkappaB,NFκB) 作为B细胞中κB轻链表达的调控元件，其家族的功能和调控一直是研究的热点。免疫系统识别抗原并通过NFκB传递信息、由NFκB失调引发的疾病等相关研究进展，使得这个可诱导转录因子受到了越来越广泛的关注。近年来，发现它是多种信号转导途径的汇聚点，并与肿瘤关系密切，其激活直接参与肿瘤细胞增殖、凋亡的调节[1-4]。转录因子圈套策略(transcription factor “decoy” strategy)是最近发展为进行体内外基因调控研究的强有力工具，它比反义寡核苷酸更具有高效性和选择性。它应用与顺式元件相一致的寡核苷酸双链转染细胞，竞争结合转录因子特异性一致性序列，从而抑制内源性基因表达[5-6]。本实验设计并合成针对NFκB的圈套寡核苷酸，在观察它对NFκB活性改变的同时，研究它对肝癌细胞HepG2凋亡的影响，并探讨其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　肝癌细胞株HepG2购自武汉大学典型生物保藏中心，RPMI1640培养液购自北京中山生物技术公司，脂质体Lipofect 2000和新生牛血清购自Gibcol公司，T4寡核苷酸激酶购自美国Promega公司，poly(dIdC)购自Sigma公司，[γ32P]ATP(370 MBq/m) 购自北京亚辉公司，NFκB圈套寡核苷酸、错义链、荧光FITC标记的圈套寡核苷酸及探针由大连宝生物公司合成， TUNEL试剂盒、Bcl2和Fas兔抗多克隆抗体购自深圳晶美公司。

　　1.2 NFκB圈套寡核苷酸的设计及培养

　　针对NFκB设计圈套寡核苷酸，序列为5′CCT TGA AGG GAT TTC CCT CC3′，3′GGA ACT TCC CTA AAG GGA GG5′由大连宝生物公司合成，同时合成带荧光FITC标记的圈套寡核苷酸及错义链5′TTG CCG TAC CTG ACT TAG CC3′，3′AAC GGC ATG GAC TGA ATC GG5′作为对照。实验分3组：对照组;转染NFκB圈套寡核苷酸组;转染错义NFκB圈套寡核苷酸组。取10 μL(10 mol/L)寡核苷酸+100 μL无血清培养基(A管)，10 μL脂质体+100 μL无血清培养基(B管);二者混合后室温下静置30 min;取生长良好、融合达70%的HepG2细胞，无血清培养基洗涤2次，加入上述混合液，补充无血清培养基置细胞培养12 h;取出，加入完全培养基。将上述培养细胞以5×105 /mL转入6孔板培养，每日各取4孔，取其平均值，描绘生长曲线。同时用荧光FITC标记的NFκB圈套寡核苷酸转染HepG2细胞，荧光倒置显微镜和共聚焦显微镜下观察其定位。共聚焦显微镜激发波长为 488 nm，发射波长为508 nm。

　　1.3 NFκB 活性检测

　　收集细胞，PBS洗3次，再悬于buffer A，冰上孵育15 min，加入终浓度为0.6%的NP40，剧烈涡旋混合10 s。置冰反应1 min，2 000 r/min离心5 min沉降，沉降的核内容物4 ℃抽提30 min，15 000 r/min离心20 min。上清液于透析缓冲液中透析3 h，再15 000 r/min离心20 min，上清即为胞核抽提物。BCA法检测提取液蛋白浓度。

　　凝胶阻滞法(electrophoreretic mobility shift assay,EMSA)检测NFκB活性: 依照Hess等[7]的方法进行。本研究以未经干预和转染错义NFκB圈套寡核苷酸的细胞为对照观察不同冷探针浓度下肝癌细胞HepG2 NFκB活性变化。

　　1.4 流式细胞仪测凋亡

　　上述细胞用冰预冷的PBS洗2次后，0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，离心，70%乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色后，流式细胞仪(FACSort)检测细胞凋亡，具体操作见文献[8]。

　　1.5 TUNEL测凋亡

　　取生长良好HepG2细胞制成5×105密度单细胞悬液，接种于预先放入盖玻片(多聚赖氨酸预处理)的六孔培养板，待细胞融合70%时，脂质体转染，48 h后停止培养，取出盖玻片，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定1 h，余按试剂盒说明进行。每一样品均设阴性对照(不加TdT酶)，DAB显色，细胞核内出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞即凋亡阳性细胞。光镜下计数凋亡细胞数，以百分数表示，即凋亡指数(apoptotic index,AI)。

　　1.6 Western blot

　　参照文献[9]，三去污剂法提取细胞总蛋白，取20 g蛋白，6%SDSPAGE凝胶电泳，半干电转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入1∶1 000 稀释的Bcl2兔抗多克隆抗体或Fas兔抗多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，加入1∶5 000过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，洗涤，ECL方法显像。

　　1.7 统计学处理

　　应用SPSS13.0统计软件进行分析,各指标以x±s表示，多组间比较用方差分析及q检验，P<0.05为差异，有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 NFκB圈套寡核苷酸的胞内定位

　　荧光镜下发现FITC标记的NFκB圈套寡核苷酸在脂质体介导下进入细胞，30 min后大多进入细胞质并呈离散型、点状分布，1 h后主要集中于细胞核(图1)，细胞核荧光聚集，4 h后开始减弱，8 h后荧光消失。

　　共聚焦显微镜进行核内定位观察可见转染1 h后NFκB圈套寡核苷酸进入细胞核并呈离散型、点状分布，表明NFκB圈套寡核苷酸已进入细胞核(图2)。

　　2.2 转染前后NFκB活性的变化

　　在2倍于冷探针浓度时，NFκB圈套寡核苷酸开始明显抑制肝癌细胞HepG2 NFκB的活性，在20倍时几乎能完全抑制NFκB的活性，而错义NFκB圈套寡核苷酸则对NFκB的活性无明显抑制作用(图3)。

　　图3 EMSA检测NFκB 的结合活性

　　1：正常HepG2组;2：转染错义组;3：转染正义组(1倍探针);4：转染正义组(2倍探针);5：转染正义组(20倍探针);6：转染正义组(30倍探针)

　　2.3 NFκB圈套寡核苷酸的体外生长抑制实验

　　用NFκB圈套寡核苷酸处理HepG2细胞后，NFκB圈套寡核苷酸组生长曲线低于对照组和错义NFκB圈套寡核苷酸组，细胞生长受到明显抑制(图4)。

　　图4 NFκB圈套寡核苷酸对HepG2

　　细胞增殖的影响

　　2.4 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况

　　流式细胞仪检测对照组、转染NFκB圈套寡核苷酸组、转染错义NFκB圈套寡核苷酸组的凋亡率分别是(4.02±1.52)%、(32.31±5.78)%、(13.26±2.86)%。转染NFκB圈套寡核苷酸组与其它两组比较有统计学差异(P<0.05)。

　　2.5 TUNEL检测各组细胞的凋亡情况

　　A、B、C 3组的凋亡指数分别为(4.5±2.1)%、(18.6±3.1)%、(6.2±2.6)%。B组与其它两组比较有统计学差异(P<0.05)。

　　2.6 Bcl2和Fas的Western blot定量分析结果

　　Bcl2的Western blot定量分析发现：A组(43.6±2.1)和C组(52.3±2.4)的含量分别是B组(22.5±1.6)的2.2和2.4倍(图5)，有显著差异(P<0.05)，说明B组Bcl2的含量明显低于其他两组。Fas的Western blot定量分析发现：B组(41.6±1.9)的含量是A组(15.6±2.4)、C组(18.1±1.4)的2.8和2.6倍(图6)，有显著差异(P<0.05)，说明B组Fas的含量明显高于其他两组。

　　3 讨论

　　NFκB普遍存在于细胞胞浆中，并与抑制性蛋白IκB结合而成为非活性状态。当受到外界各种刺激时， NFκB就活化进入细胞核内，随后与胞核内某些基因的启动子或增强子结合，调控编码细胞因子、生长因子、细胞粘附分子和急性蛋白的基因表达，其激活与某些肿瘤发生、发展有关[1-2]。NFκB特别是ReLA亚基对肿瘤生长起重要作用，它能上调cmyc,bcl3等原癌基因的表达，使凋亡抑制蛋白和肿瘤生长受体相关因子转录增加。它还可以阻断Fas介导的凋亡通路，从而抑制肿瘤细胞的凋亡[3-4]。有研究发现如果抑制NFκB活性或阻止IκB降解可以促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长[10]，但目前尚缺乏特异性NFκB抑制剂。

　　圈套(诱骗)策略是指在细胞内注入人工合成的竞争性、和转录因子特异性一致性序列结合的圈套寡核苷酸，其削弱转录因子与靶基因启动子的结合，从而下调靶基因的表达。圈套寡核苷酸被认为是体内、外基因调控研究的有力工具。Sharma[11]的研究成果发现应用针对ReLA的圈套能显著抑制人SW480结肠癌和KBALB鼠成纤维肉瘤细胞的生长。本实验发现HepG2细胞在常态下，NFκB有一定程度的活化，而活化的NFκB可维持细胞的生长，增加细胞对外界环境变化干扰的耐受;但针对性的设计NFκB圈套寡核苷酸，将其转染人肝癌细胞HepG2后，可直接定位于细胞核，EMSA显示NFκB活性较转染前降低，证实NFκB圈套寡核苷酸可以作为NFκB的特异性抑制剂。

　　肿瘤的发生、发展过程实质是细胞的增殖与凋亡过程的失衡。促凋基因包括p53、fas等，其中fas以膜分子形式存在，能感受细胞外死亡信号而诱导凋亡。抑凋基因主要作用是抑制细胞凋亡、延长细胞寿命，包括bcl2等。促凋、抑凋失衡即可导致肿瘤发生，二者的比例决定了细胞是否走向凋亡，如bcl2表达增加则细胞存活，而fas表达增加则细胞凋亡。本研究发现体外应用NFκB圈套寡核苷酸干预肝癌细胞HepG2，不但降低NFκB的活性、延缓细胞生长、促进凋亡，而且使抗凋亡蛋白Bcl2水平下调、凋亡蛋白Fas表达上升，由此推测 NFκB圈套寡核苷酸不仅通过竞争性抑制NFκB与核内靶基因的结合下调NFκB的活性，而且通过调节凋亡蛋白的表达改善增殖与凋亡的平衡而延缓肿瘤细胞的生长。提示NFκB 圈套寡核苷酸作为一种NFκB特异性抑制剂，能抑制体外HepG2细胞的生长，为临床肝癌治疗提供了一个除反义技术和基因沉默技术外的新思路。

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