银杏内酯对老年哮喘患者外周血Th1/Th2型细胞因子的作用

　　作者：王笑英 吴春风 陈静 干咏华 作者单位：(吉林省人民医院干部病房呼吸疗区，吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 探讨银杏内酯对老年哮喘患者外周血T淋巴细胞Th1/Th2型细胞因子的作用及其治疗哮喘的可能机制。方法 采用流式细胞术检测25例健康体检者正常对照组和25例老年支气管哮喘急性发作期患者单个核细胞(PBMC) 经银杏内酯干预后 Th1型细胞因子(IFNγ)和Th2型细胞因子(IL4)水平及Th1/Th2比值变化。结果 与正常组比较，哮喘组Th2型细胞因子(IL4)水平显著增高(P<0.01)，哮喘组Th1/Th2比值显著减低 (P<0.01)。哮喘组银杏内酯体外干预后Th2型细胞因子(IL4)水平较干预前显著减低(P<0.01)，Th1/Th2比值较较干预前显著增高(P<0.01)。结论 银杏内酯具有抑制哮喘Th2细胞亚群优势反应和调节免疫平衡的作用。

　　【关键词】 银杏内酯;支气管哮喘;Th1/Th2;流式细胞术

　　近年研究表明Th1/Th2免疫反应失衡，Th2型优势反应是哮喘发生的重要机制〔1，2〕，调节Th1/Th2反应失衡对支气管哮喘具有积极治疗作用。银杏内酯为银杏叶提取物中的重要有效成分之一，具有抗自由基、抑制炎症反应及调节机体免疫等功能〔3〕。本文采用流式细胞术(FCM)以正常老年人为对照，观察了25例老年支气管哮喘急性发作期以及体外银杏内酯干预前后外周血单个核细胞(PBMC) 的Th1型细胞因子(IFNγ)和Th2型细胞因子(IL4)水平变化，从细胞因子水平探讨银杏内酯治疗哮喘的可能机制，并为其临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例选择 选择本院2005年10月至2007年10月住院的老年支气管哮喘急性发作期患者25例，男14例，女11例，年龄60-83岁，平均68.23岁，诊断标准均符合中华医学会2003年哮喘诊断与分级指南〔4〕，采血前8 w未用过糖皮质激素。正常体检的健康老年人25例作为对照，男13例，女12例，年龄62-72岁，平均65.12岁。

　　1.2 仪器与试剂 EPICS XL型流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品。CD3PECy5、CD8FITC、IFNγPE、IL4PE 以及破膜剂(Permeabilisation)、固定剂(Fixation)均购自Immunotech公司。佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)、莫能霉素(Monensin) 和银杏内酯(BN52021)购自Sigma公司。RPMI 1640购自Hyclone公司。

　　1.3 PBMC的分离 取EDTAK2抗凝全血2 ml，加入等量PBS稀释，将稀释好的全血用滴管沿管壁缓慢加在适量淋巴细胞分离液(Ficoll)液面上，2 000 r/min离心30 min。收集PBMC，加入PBS 3 ml，1 200 r/min离心洗涤10 min，弃上清。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬，将哮喘组和正常对照组的PBMC分别接种至24孔板内，细胞密度为1×107/ml。每组设空白对照孔和银杏内酯(以DMSO溶解，终浓度为10 μmol/L)干预孔各3复孔，37℃、5% CO2培养箱中培养48 h。

　　1.4 膜表面标记及胞内细胞因子染色 取上述各组每孔培养的PBMC加PMA(25 ng/ml)、Ionomycin (1 μg/ml)和Monensin(2 μg/ml)，37℃、5% CO2培养箱中刺激培养4-6 h，离心洗涤。取刺激培养的PBMC 100 μl，加入20 μl CD3PECy5和20 μl CD8FITC作为待测样品管，漩涡混匀，室温避光孵育15 min，进行细胞膜表面标记。将样品管离心洗涤，重悬制成单细胞悬液，加入100 μl固定剂轻轻混匀，室温避光孵育15 min;离心洗涤，弃上清，加入100 μl破膜剂，室温避光孵育5 min，离心洗涤。将样品管细胞平分成两管，分别加入10 μl IL4PE和10 μl IFNγPE，漩涡混匀，室温避光孵育15 min，进行胞内细胞因子染色。离心洗涤，弃上清，加300 μl PBS混匀，上机检测。

　　1.5 FCM检测分析 以前向角(FS)和侧向角(SS)散点图设门区分PBMC，根据文献〔5〕对门内CD3+的T淋巴细胞进行分析，每管收集1×104个细胞。用EXPO32 ADC Analysis软件分析Th1(CD3+/CD8-/IFNγ+)和Th1 (CD3+/CD8-/ IL4+)的含量并计算Th1/Th2比值。

　　1.6 统计学分析 所有数据用SPSS 10.0统计软件进行统计，结果以x±s表示，组间方差相等采用t检验，方差不等采用秩和检验。

　　2 结果

　　见表1。与正常对照组相比，哮喘组患者Th1型细胞因子(IFNγ)的水平无显著差异 (P>0.05)，哮喘组Th2型细胞因子(IL4)水平显著增高(P<0.01)，哮喘组Th1/Th2比值显著减低 (P<0.01)。哮喘组银杏内酯体外干预后Th1型细胞因子(IFNγ)水平与干预前比较无差异(P>0.05)，Th2型细胞因子(IL4)水平较干预前显著减低(P<0.01)，Th1/Th2比值较干预前显著增高(P<0.01)，而与正常对照组无显著差异(P>0.05)。正常对照组银杏内酯干预前后Th1型细胞因子(IFNγ)水平、Th2型细胞因子(IL4)水平及Th1/Th2比值无显著差异(P>0.05)。

　　表1 老年支气管哮喘患者银杏内酯干预前后PBMC的Th1,Th2表达水平及Th1/Th2比值(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01;与空白组比较：2)P<0.01

　　3 讨论

　　人类CD4+辅助性T细胞(CD4+Th)根据其分泌的细胞因子不同分为Th0、Th1、Th2和Th3 4个亚群。其中，Th1细胞主要分泌IL2、IFNγ等细胞因子，与TDTH细胞和Tc细胞的增殖、分化及成熟有关，能促进细胞介导的免疫应答，Th2细胞主要分泌IL4、IL5、IL6、IL10等细胞因子，与B细胞增殖、分化、成熟和促进抗体生成有关，可增强抗体介导的体液免疫应答〔6〕。正常情况下Th1和Th2两种细胞亚群借助其分泌的细胞因子形成负反馈，相互制约，维持平衡。某些因素作用下一旦失去平衡，则出现Th1型或Th2型优势反应，引发异常免疫应答，造成病理状态。本研究以IFNγ和IL4为Th1和Th2的特征性细胞因子，通过检测这两种细胞因子了解支气管哮喘患者Th1和Th2的功能状态。结果表明，哮喘组Th2型细胞因子(IL4)水平显著增高，与Tavakkol 等〔1〕结论一致，证实支气管患者体内存在Th1/Th2失衡，反应向Th2型漂移，这为下一步应用银杏内酯进行干预作用提供了依据。

　　银杏内酯为银杏叶提取物中重要的有效成分，Mahmoud等〔7〕在BN52021与环孢素A对哮喘患者外周血激活的淋巴细胞体外影响的研究中发现，BN52021可以明显减少外周血单核细胞IL4、IL5等细胞因子的释放，提示银杏内酯通过抑制IL4等Th2型细胞因子的释放，进而抑制了IgE介导的速发型变态反应和呼吸道炎症反应。本试验结果显示银杏内酯干预后，Th2型细胞因子(IL4)水平较干预前显著减低(P<0.01)，Th1/Th2比值较干预前显著增高(P<0.01)，推断其具有抑制Th2细胞亚群优势反应和调节免疫失衡的作用。

　　支气管哮喘目前以应用糖皮质激素抑制气道非特异性炎症反应治疗为主，老年人多合并有糖尿病、消化性溃疡等基础性疾病，应用激素治疗往往受限。本研究结果表明银杏内酯对体外培养的哮喘患者PBMC细胞Th2型特征性细胞因子(IL4)的分泌具有抑制作用，但在临床哮喘治疗中是否能够部分或完全代替糖皮质激素还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Tavakkol AJ，Farid HR，Hosseini FS,et al.Association of the expression of IL4 and IL13 genes，IL4 and IgE serum levels with allergic asthma〔J〕.Iran J Allergy Asthma Immunol,2007;6(2):6772.

　　2 Truyen E，Coteur L，Dilissen E,et al.Evaluation of airway inflammation by quantitative Th1/Th2 cytokine mRNA measurement in sputum of asthma patients〔J〕.Thorax,2006;61(3):2028.

　　3 Liu KX，Wu WK，He W,et al.Ginkgo biloba extract (EGb 761) attenuates lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats：roles of oxidative stress and nitric oxide〔J〕.World J Gastroenterol，2007;13(2):299305.

　　4 中华医学会.支气管哮喘防治指南〔J〕.中华内科杂志,2003;42(11):81722.

　　5 曹云新,金伯泉,韩卫宁.CD3/CD8设门在FCM检测Th1/Th2亚型中的应用〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2002;18(6):6389.

　　6 陈慰峰.医学免疫学〔M〕.北京,人民卫生出版社，2002：924.

　　7 Mahmoud F,Abul H,Onadeko B,et al.In vitro effects of ginkgolide B on lymphocyte activation in atopic asthma：comparision with cyclosporine A〔J〕.Jpn J Pharmacol,2000;83(3):2415.