慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中肺表面活性蛋白D的表达与临床意义

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种具有持续气流受限特征的疾病,呈进行性发展,其发病与吸人有害气体或有害颗粒引起的肺部异常炎症反应有关[l]。缺乏一个特异的、有效的、稳定的评价COPD严重程度及预后的指标成为研发新药和发现新的治疗方法的障碍。

 COPD是一种累及气道、肺泡壁和肺血管的慢性炎症性疾病已达到共识。炎症因子通过极其复杂的途径造成肺组织的病理损伤,目前已发现大量炎症因子与COPD有关,血的纤维蛋白原和C反应蛋白也已广泛应用于COPD相关的临床试验及病情评估[2],其他因子如白介素8(IL-8)、IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α、y干扰素等在COPD中所起的作用也已研究的比较清楚,虽然近年叉发现一些与 COPD炎症调节密不可分的囚子如sRAGE、 NGAL、脂联素、HSP27等[3-5],但以上这些炎症因子仍缺乏特异性9不能针对性的反映肺部的炎症水平。

SP-D是主要由肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞与细支气管calar细胞分泌并参与炎症反应的肺部特异性蛋白。Welt等Ι发现先天缺乏SP-D的小鼠极易发生肺部的慢性炎症,肺气肿及肺纤维化,而且金属蛋白酶的活性和氧化应激反应也异常增强,推断SP-D可能有抗炎、抗氧化的作用。Ju等[7]通过对处于COPD急性加重期和稳定期的患者血中 SP-D的检测并结合BODE的结果,提出SP-D可能成为反映COPD严重程度的生物指标。SP-D表达的升高间接反映了炎症程度的加重.其表达的降低可能引起严重的肺损伤。在研究SP-D与COPD关系时,灌洗液与血的标本中SP-D的变化不一致[8-9],国内一些研究发现SP-D在吸烟诱导的 COPD大鼠肺组织中表达是减少的[10],但是在国外的研究显示吸烟诱导的肺气肿肺组织中SP-D表达却是增高的[11-12]。SP-D在人肺组织中表达研究甚少,本研究将通过观察SP-D在不吸烟非COPD组、吸烟非COPD组与吸烟COPD组三组人的肺组织中的表达进一步明确COPD患者肺组织SP-D表达情况及与COPD的关系。

1 对象和方法

 1.1 对象 2010年10月至2010年10月因肺癌行肺叶切除术的30例患者,其中不吸烟非COPD 者10例,吸烟非COPD者10例,吸烟COPD患者 10例。各组在年龄分布、性别组成上差异无统计学意义(P>0.O5),吸烟非COPD组与吸烟COPD组的吸烟指数差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。 COPD的诊断标准满足2011年COPD全球策略修订版,入选病例不合并其他慢性病如支气管扩张、支气管哮喘、肺间质纤维化、矽肺,且无`心脏病、肝衰竭、肾衰竭等慢性系统性病变,手术前一周均作肺功能检查,所有受试者处于稳定期。本研究项目经天津医科大学总医院伦理委员会审查批准,术前患者了解实验方案并签署知情同意书及标本处理同意书。

1.2 方法 实验所用肺组织取自远离肺癌病灶 (125px以上),肉眼观察无肺癌浸润的外周肺组织。用SP免疫组织化学技术检测三组受试者SP-D在气道上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、巨噬细胞中的表达。组织标本以5um厚度连续切片,经脱蜡、梯度乙醇水化.柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)抗原微波修复15min,3%的H201封闭10min,PBS洗涤,兔抗人SP-D多克隆抗体(稀释浓度1:50一北京博奥森生物技术有限公司)分别37.5°C孵育1h,PBS 洗涤,分别加人羊抗鼠/兔多克隆抗体(福州迈新生物技术开发有限公司),37°C孵育20 min,PBS洗涤,DAB显色,苏木精复染,脱水、透明、并树胶封片。用PBS代替一抗做阴性对照。

1.3 结果判断 胞浆内有黄色颗粒的为染色阳性细胞,观察阳性细胞表达部位,高倍镜(× 400)下计数5个视野的细胞,免疫组织化学染色总分为染色细胞阳性率与细胞染色强度之和,细胞染色强度评分从0分到3分(无显色,0分;淡黄色,1分;棕黄色,2分;棕褐色,3分);染色细胞阳性率评分从0分到3分(≤ 5%,0分;6%~10%,1分;11%~50%,2分;51%≤ ,3分)[13]。总分0分为阴性(-),1~2分为弱阳性(+),3~4分为中等阳性(++),5~6分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法 结果采用SPSS17.0软件包进行统计分析。计数资料采用x2检验,计量资料以 x土s表示,组间差异显著性比较采用F检验,组间两两比较采用LDS检验,等级资料采用秩和检验, 相关性分析采用Spearman相关分析。P<O.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织SP-D的表达 胞质显示有黄色提示细胞有SP-D阳性表达,不吸烟非COPD、吸烟非COPD、吸烟COPD三组的气道上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞胞浆均有表达(图1~6)。 COPD组与吸烟非COPD组内气道上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞均可见大量强阳性表达,吸烟非 COPD组显示比COPD组表达更强(图2,3,5,6). 不吸烟非COPD组显示较弱阳性表达(图1.4)。 COPD组与吸烟非COPD组的巨噬细胞可见强阳性表达(图5,6),不吸烟非COPD组显示较弱阳性表达(图4)。

2.2 肺组织SP-D的表达的半定量分析 三组中 SP-D在①气道上皮细胞的表达吸烟非COPD组强于COPD组(P=0.023),前两者又都强于不吸烟非COPD组的患者(P=0.000,P=0.O09);② Ⅱ 型肺泡上皮细胞的表达吸烟非COPD组强于 COPD组(P=0.015),前两者叉都强于不吸烟非COPD组的患者(P=0.00,P=0.022);③ SP-D 在肺泡巨噬细胞的表达吸烟非COPD组与COPD 组差异无统计学意义(P=0.313),但前两者都强于不吸烟非COPD组的患者(P=0.0O,P= 0.005)。具体结果见表2。

2.3 COPD患者肺组织SP-D的表达与肺功能的关系 COPD组中,SP-D在气道上皮细胞的表达强度与FEV1/FVC、FEV1%pred呈正相关(r= 0.505,r=O.563)( P<0.05);SP-D在Ⅱ型肺泡上皮细胞中的表达强度与FEV1/FVC、FEV1%pred 呈正相关(r=0,687,r=0.687)(P<0.05); SP-D在肺泡巨噬细胞中的表达强度与FEV1/FVC、 FEVI%pred呈正相关(r=O.639,r=0.74)(P< 0.05)。

 3 讨论

 COPD是一种具有气流受限特征的疾病,气流受限不完全可逆,呈进行性发展,其发病与肺部对有害气体或有害颗粒尤其是吸烟所引起的异常炎症反应有关。大量研究证实,COPD是一种炎症性疾病, 即使在COPD的稳定期体内仍存在持续的炎症反应。持续的炎症反应导致气道和肺组织的结构的破坏,进一步导致肺丧失原有的生理功能。SP-D属于胶原凝集素家族,主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞与calar 细胞分泌,巨噬细胞将其吞噬进行分解保持其在肺组织的平衡,SP-D以调节兔疫和炎症为主,同时也有降低肺泡表面张力的作用。在一些动物实验中发现SP-D基因缺陷的小鼠极易发生肺气肿,提示 SP-D可能在维持肺组织的正常生理功能中起到重要作用,COPD的发生和发展可能与其存在密切的关系。

在本研究中我们发现,SP-D在细支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞胞浆均有阳性表达,COPD组炎症病理表现及对气道和肺组织的破坏明显高于单纯吸烟组和健康对照组,吸烟非COPD组及吸烟COPD组SP1)表达均强于不吸烟的健康对照组,此结果提示吸烟可能是促进SP-D 生成增加的重要诱因,稳定期COPD患者肺部存在较强的持续的炎症反应。吸烟作为COPD发生、发展的最重要的诱因已被广泛认知,吸烟可导致气道的慢性炎症,炎症的长期损害进一步诱发肺气肿。这也同时验证了Hirama等[l2]的动物实验结果,即吸烟可诱发促SP-D生成因子和SP-D的mRNA表达增加,还诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞异常增生。长期大量吸烟会引起肺部强烈且持续的炎症反应,SP-D 作为人体内天然的抗炎物质通过反应性的上调来对抗吸烟诱发的肺部炎症损伤。因此,吸烟可能为 SRD在肺组织中升高的重要诱因。

 SP-D在吸烟非COPD组和CC)PD组气道上皮和Ⅱ型肺泡上皮细胞表达增加被大部分学者认为是由于机体抵抗炎症、氧化应激等破坏所产生的代偿反应,但在炎症更加剧烈的COPD的肺组织表达较吸烟非COPD减少的机制仍不清楚。本实验发现 COPD组产生SP-D的calar细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞大量坏死、脱落,并且大量肺泡断裂、肺间质变薄.因此COPD患者肺部SP-D表达减弱的原因可能由于SP-D生成减少,漏出增加,这也与Winkler 等[9]的灌洗液SP-D水平下降而血中升高的结果一致。因巨噬细胞有吞噬 `分解SP-D的作用但并不产生SP-D,因此在COPD组与吸烟组的表达无明显差异。

吸烟COPD组SP-D的表达弱于吸烟非COPD组,但是COPD组的病理显示在肺组织有大量炎细胞浸润和极其严重的炎症破坏,COPD患者的肺部炎症表现明显较单纯吸烟者重。结果提示当SP-D 水平降低时,气道与肺组织结构遭到炎症破坏加重, COPD的发生与进展很可能与SP-D表达水平有一定关系。肺功能尤其是FEV1%pred是反映肺组织结构破坏导致气流受限的一个良好的指标。目前有些研究显示,血SP-D与稳定期C(DPD气流受限严重程度无关[14],在COPD的急性加重中明显升高[15],由于其他器官也可分泌少量SP-D,可能血中 SP-D与COPD的研究受一些不可预知的因素影响较大,因此直接研究COPD患者肺组织中SP-D的表达则更直观且准确。在此研究中我们发现吸烟COPD组无论是气道上皮、肺泡上皮,还是肺泡巨噬细胞的SP-D的表达均与肺功能呈正相关。由此结果得出SP-D在COPD肺组织的破坏、气流受限的形成中可能有重要作用。SP-D作为肺部天然的抗炎、抗感染物质,它在肺中表达水平的下降很可能会使肺组织破坏更加严重,气流受限加剧,缺乏足够的 SP-D可能为COPD的发生以及病情进展的重要因素。因此,可考虑将SP-D作为评价COPD严重程度的重要指标。

 Knudsen等[16]通过用人工重组的SP-D治疗先天缺乏SP-D的小鼠,结果显示由于SP-D缺乏引起的Ⅱ型肺泡上皮细胞异常增生明显改善。以上提示我们,SP-D可能在对COPD的预防和治疗中起到关键的作用。SP-D作为人体的天然屏障之一,本研究提示SP-D与吸烟、气流受限的严重程度密切相关,说明其在炎症反应与肺气肿形成过程中起到重要的作用,可能在COPD今后的预防、病情评估或者治疗中有一定的意义,但是COPD的发生机制极其复杂,SP-D在COPD患者血、灌洗液、肺组织中表达不一致,而且SP-D与其他炎症因子之间的相互作用尚不明确,对COPD的预防和治疗的效果仍不能确定,针对这些问题,对将来的研究提出了更大的挑战。

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