乌司他丁对体外循环中激活的白细胞和血小板作用的研究

作者：刘明政    作者单位：中国医学科学院 【摘要】  目的 研究体外循环(extracorporeal circulation,ECC)下心脏直视手术中乌司他丁对激活的白细胞和血小板功能的作用。方法 30例择期ECC下冠状动脉搭桥患者随机分为两组：对照组(C组，n=15)和乌司他丁组(U组，n=15)。对照组ECC中不给予乌司他丁，试验组围ECC期给予乌司他丁100万单位 (其中30万为麻醉诱导前给予，40万预充ECC机内，30万为开放升主动脉后给予)。分别于麻醉诱导后(T1)、阻断升主动脉后30 min (T2)、再灌注3 h(T3)、6 h (T4)及12 h (T5)各时间点取静脉血测定中性粒细胞弹性蛋白酶（PMNE）的水平；并于麻醉诱导后(Ta)、ECC结束后给鱼精蛋白前（Tb）、鱼精蛋白中和后1 h(Tc)、术后24 h(Td)提取全血标本测定CD62p的表达。此外，于ECC前、后抽取动脉血气监测肺泡动脉血氧梯度（A-aDO2）。结果 两组血清中PMNE的浓度在T2、T3、T4、T5各时间点都明显高于T1时间点(P<0.01)，U组的PMNE水平明显低于对照组(P<0.05)。Tb、Tc、Td时间点两组CD62p的表达明显高于Ta时间点，但是两组之间没有明显差异。相比较对照组，U组的A-aDO2明显低于对照组，且患者机械通气时间低于对照组。结论 在ECC过程中乌司他丁可以通过PMNE的释放从而减轻肺脏的缺血再灌注损伤，但是并没有起到抑制血小板激活的作用。 【关键词】  乌司他丁 白细胞 体外循环 心脏外科    Effects of Urinary Protease Inhibitor on Activated Leukocytes and    Platelets during Extracorporeal Circulation    LIU Ming-zheng1, JI Bing-yang2, WANG Gu-yan1, LIU Jin-ping2, LI Li-huan1    (1.Department of Anaesthesiology;2.Department of Cardiopulmonary Bypass,    Cardiovascular Institute and FuWai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100037,China)    Abstract: OBJECTIVE   To investigate the influence of high-dose ulinastatin on cytokines and platelet activation during and after extracorporeal circulation（ECC）. METHODS  30 patients with coronary artery disease (CAD)  undergoing coronary artery bypass graft (CABG) were randomly divided into two groups: U group (n=15) received a total dose of 1000000 U ulinastatin and C group (n=15) received placebo. Blood samples were withdrawn from the central vein to measure polymorphonuclear neutrophil elastase (PMNE), before induction, 30 min following clamping (T2), reperfusion 3 h (T3), reperfusion 6 h (T4) and reperfusion 12 h (T5). Whole blood samples were taken for CD62p immediately before induction (as baseline), at the end of ECC (before protamine administration), 1 h after heparin neutralization by protamine and 24 h after the operation. In addition, alveolo-arterial oxygen difference (A-aDO2) in pulmonary gas exchange function was calculated by obtaining arterial blood gas samples before and after ECC. RESULTS  There were no differences in preoperative parameters between two groups. After ECC, the levels of PMNE increased in both groups over baseline values (P<0.01). The levels of PMNE, in U group were significantly lower than those in C group (P<0.05). No significant differences in CD62p expression between the 2 groups during ECC were found. A-aDO2 in U group significantly decreased compared with C group (P<0.05) and the duration of mechanical ventilation was shorter than C group (P<0.05). CONCLUSION  Results suggest that ulinastatin may inhibit PMNE release, reduce reperfusion lung injury and preserve pulmonary function but it fails to inhibit platelet activation and to prevent blood loss during ECC Key words：  Ulinastatin;Leukocytes;Extracorporeal circulation;Cardiac surgery   在体外循环(extracorporeal circulation,ECC)下进行的心外直视手术中，由于血液与非生物表面接触、缺血再灌注损伤、内皮损伤等因素促使大量的炎性介质释放引起术后各种主要脏器的损伤［1］。ECC过程中的中性粒白细胞和血小板的激活能介导大量蛋白酶和炎性因子的产生从而影响患者术后的肺功能以及与血小板有关的凝血功能［2］。乌司他丁作为一种蛋白酶抑制剂目前已经在心血管临床上普遍应用并取得了较好的应用效果。在我们前面的研究中已经对乌司他丁对于炎性因子的作用进行了观察和描述［3］。本研究将通过观察中性粒细胞弹性蛋白酶（PMNE）的水平结合临床肺功能指标来观测乌司他丁对激活的白细胞的作用；同时应用流式细胞仪观察乌司他丁对激活血小板的作用。    1  资料与方法     1.1  临床资料  选择择期ECC下冠状动脉搭桥术患者30例，随机分为乌司他丁组（U组,）和对照组（C组）,每组各15例。两组临床资料见表1。表1  术前临床资料参数

    1.2  麻醉和ECC方法  全部患者采用静吸复合麻醉。行桡动脉、颈内静脉穿刺置管，分别监测平均动脉压以及中心静脉压。ECC采用Stockert-Shilly体外循环机，Baxter膜式氧合器。预充液为乳酸林格氏液1000 ml，4%琥珀酰明胶1000 ml，并适量加入5% NaHCO3、10% MgSO4、CaCl2等电解质溶液。预充液内加入肝素2000 U，体内肝素化剂量为400 U/kg，使ECC中ACT维持480 s以上，血细胞压积维持在0.20～0.30。

    1.3  给药方法  U组患者在围ECC期共用乌司他丁100万IU，其中30万IU为麻醉诱导前给予，40万IU预充体外循环机内，30万IU为开放升主动脉后给予；C组患者于围术期未用该药。

    1.3.1  血样采集  分别于麻醉诱导后(T1)、阻断升主动脉30 min(T2)、再灌注3 h(T3)、再灌注6 h (T4)及再灌注24 h(T5)各时间点取静脉血,用ELISA法测定样本中PMNE的水平;并于麻醉诱导后(Ta)、ECC结束后(Tb)、鱼精蛋白中和后1h(Tc)和术后24 h(Td)提取全血标本应用流式细胞仪测定CD62p。同时监测ECC前、后肺泡动脉血氧梯度(A-aDO2)。

    1.4  统计学处理  应用SPSS 10.0统计软件进行统计分析,各项数据用均数±标准差(±s)表示，组内和组间比较用均数t检验，P＜0.05为有显著性差异。

    2  结  果

    2.1  两组患者的年龄、体重、最低鼻咽温、阻断时间、心肌保护用液量、ECC时间无明显差异。见表1和表2。表2  术中和术后临床资料参数注：与C组相比*P＜0.05

    2.2  两组血清中PMNE的浓度在T2、T3、T4、T5各时间点都明显高于T1时间点(P<0.01)，U组的PMNE水平明显低于对照组(P<0.05),见表3。Tb、Tc、Td时间点两组CD62p的表达明显高于Ta时间点，但是两组之间没有明显差异(P＞0.05),见表4。与ECC前（C组239.0±34.2 mmHg，U组246.8±31.7 mmHg）比较，两组的A-aDO2明显升高(C组331.7±21.4 mmHg,U组271.5±19.1 mmHg)(P<0.05) ,U组的A-aDO2明显低于C组(P=0.043),见图1，且患者机械通气时间低于对照组(P<0.05),见表2。图1  两组A-aDO2对比 注  与ECC前基础值比较*P<0.05；组间比较表3  两组各时间点白细胞计数和PMNE水 注：与术前基础值相比较*P＜0.05，组间相比较#P<0.05表4  两组各时间点血小板和CD62p表达水平注：与术前基础值比较*P＜0.05

    3  讨  论

    ECC过程中由于血液与大量的异物表面直接接触、缺血再灌注损伤等因素而引发机体的一系列炎性反应，包括补体系统、中性粒细胞、纤溶系统以及血小板的激活，引起氧自由基各种蛋白酶和炎性介质的释放；同时，缺血再灌注损伤中氧自由基作为直接的细胞损伤因素，可导致机体心、肺、肾等重要器官及血管内皮损伤，并引起凝血功能障碍［4］。由其所带来的一系列并发症严重影响了患者术后心、肺等重要器官功能和凝血机制的恢复。因此怎样能有效的避免和减小由此而带来的不良反应，从而加速患者脏器功能的恢复是非常重要的。乌司他丁（尿胰蛋白酶抑制剂）是由143个氨基酸组成的，分子量为67 000道尔顿的酸性蛋白质，是一种典型的Kunitz型蛋白酶抑制剂，具有两个互不重叠的活性功能区，对多种酶、糖和脂水解酶有抑制作用［5］。

在缺血再灌注过程中由于大量中性粒细胞的聚集和黏附于血管内皮，并且两者相互作用中，主要是单核粒细胞或内皮细胞所产生的炎性细胞因子对缺血再灌注损伤起着非常重要的作用［3-4］。中性粒细胞可释放大量蛋白酶（如弹性蛋白酶）、各种组织蛋白、胶原酶、明胶酶、血浆酶原激活因子、类胰蛋白酶、胃促胰酶等。它们中的多数也属于丝氨酸类蛋白酶。这些酶具有很强的损坏作用。ECC时，蛋白酶可能释放过多或/和抗蛋白酶消耗太多，从而导致蛋白酶和抗蛋白酶系统失衡。在ECC中，研究较多的是弹性蛋白酶，弹性蛋白酶来源于中性粒细胞和巨噬细胞的裂解释放。血浆中的弹性蛋白酶浓度在ECC开始后逐渐升高，在手术结束时达高峰。在肺再灌注期间，在左房血液中的测定值较右房为高。提示在肺缺血期间肺内中性粒细胞聚集和释放的弹性蛋白酶增多［6-9］。因此，抑制这些炎性细胞因子和弹性蛋白酶的增加，就有可能减轻再灌注损伤以及手术后的各种并发症。从本组研究的结果来看：血清中PMNE在两组中各时点与诱导后比较，均有明显增加（P<0.05）；且试验组的PMNE指标在阻升主后30min、再灌注3 h、6 h、12 h明显受到抑制（P<0.05）。说明乌司他丁在抑制白细胞激活方面有明显的作用。Hiyama等［8］通过临床实验得出结论：乌司他丁能有效的抑制由中性粒细胞激活的PMNE且间接的抑制C3a和IL-8的产生，由于大量PMNE会降低ECC后肺脏气体交换的功能，因此Hiyama暗示乌司他丁有降低再灌注后肺损伤的作用。Nakamura通过基础研究：乌司他丁不仅能抑制PMNE的释放而且能抑制由PMNE诱导的IL-8的基因表达和蛋白分泌，从而降低炎性反应对肺组织的损伤［10］。

    尽管我们在本实验过程中分次给药并且乌司他丁的总量达到100万单位，但是并没有观察到乌司他丁对于CD62p有明显的抑制作用。ECC中血小板的激活通常用CD62p表达的水平来监测，通常在低温时CD62p的表达呈现高水平。在我们的实验中，伴随ECC的进程，两组的CD62p的表达相比基础值都明显升高，但两组间没有显著差异。综上所述乌司他丁作为蛋CD62p白酶抑制剂能有效地抑制白细胞的激活但是对于血小板的激活没有显著作用。

【参考文献】  ［1］ Laffey JG,Boylan JF,Cheng DC. The systemic inflammatory response to cardiac surgery: implications for the anesthesiologist ［J］. Anesthesiology,2002,97(1):215-252.

［2］ Li S, Price R, Phiroz D,et al. Systemic inflammatory response during cardiopulmonary bypass and strategies ［J］. J Extra Corpor Technol, 2005, 37(2): 180-188.

［3］ 吉冰洋，王伟鹏，冯正义，等. 乌司他丁对心脏直视术中缺血-再灌注损伤的保护作用 ［J］. 临床麻醉学杂志,2002,18(9):457-459.

［4］ 吉冰洋，龙村.体外循环后肺损伤和急性呼吸窘迫综合征 ［J］. 心血管病学进展,2002, 23(3):158-160.

［5］ 吉冰洋，龙村.体外循环中乌司他丁对机体的保护作用 ［J］. 中国胸心血管外科临床杂志,2002, 9(1): 51-53.

［6］ Larson DF,Bowers M,Schechner HW,et al. Neutrophil activation during cardiopulmonary bypass in paediatric and adult patients ［J］. Perfusion,1996,11(1):21-27.

［7］ Miura M, Sugiura T,Aimi Y,et al.Effects of ulinastatin on PMNL and vascular endothelial injury in patients undergoing open heart surgery with CPB ［J］. Masui,1998,47(1): 29-35.

［8］ Hiyama A,Takeda J,Kotake Y,et al. A human urinary protease inhibitor (ulinastatin) inhibits neutrophil extracellular release of elastase during cardiopulmonary bypass ［J］. J Cardiothorac Vasc Anesth,1997, 11(5): 580-558.

［9］ Gando S,Tedo I. Increased neutrophil elastase release in patients with cardiopulmonary arrest: role of elastase inhibitor ［J］. Intensive Care Med,1995,21(8):636-640.

［10］ Nakamura H,Abe S, Shibata Y,et al. Inhibition of neutrophil elastase-induced interleukin-8 gene expression by urinary trypsin inhibitor in human bronchial epithelial cells ［J］. Int Arch Allergy Immunol,1997,112(2):157-162.